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支气管败血波氏杆菌的鉴定及药敏试验           ★★★
支气管败血波氏杆菌的鉴定及药敏试验
作者:贾新颖 文章来源:本站采编 点击数: 更新时间:2014-2-21 【字体:

猪萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis of swineAR)又称猪传染性萎缩性鼻炎(Infections atrophic rhinitis of swineIAR),是由支气管败血波氏杆菌(BordetellabronchisepticaBb)或产毒素多杀性巴氏杆菌(PasteurellamultocidaPm)引起的一种慢性接触性呼吸道传染病[1]。本病以鼻塞、打喷嚏、流鼻血、咳嗽、呼吸不畅、颜面变形或鼻梁歪斜为主要特征。哺乳仔猪感染本病后,除主要特征外,还可以引起全身钙、磷代谢障碍,致使仔猪发育迟缓,饲料利用率降低,有时伴发急、慢性支气管炎,导致仔猪死亡,从而给养殖业带来严重的经济损失[2-4]

AR1830年由德国学者Frangue首次报道。近几十年来,随着集约化养猪业的不断发展以及猪的引种和频繁调运,本病己经广泛分布于世界各养猪业发达地区[5]2003年-2006年,贵州省6个养猪场先后出现了疑似AR的病例,为查明病因,采集这些感染猪群鼻腔棉拭子156份进行分离,获得了34株疑似Bb分离菌。本试验对分离菌进行了形态结构、染色特性、培养性状和生化特性等方面的生物学测定,同时针对Bb FlaA基因合成一对特异引物进行PCR鉴定及药敏试验,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 34株疑似Bb分离菌(编号为B1B2……B34),分离自表现AR临床症状的6个养殖场猪群;多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和枯草芽孢杆菌,为贵州大学动物科学学院实验室冻干保存菌株。

1.1.2 主要试剂 细菌培养基、生化反应试验管、药敏纸片购自杭州微生物试剂有限公司;PCR试剂、200 bp MarkerEB为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 形态结构与染色特性测定 取34株疑似Bb分离物接种10 g/L葡萄糖麦康凯培养基,挑取单个菌落染色镜检,观察细菌分离物的形态结构;采用压滴法、硝酸银[6]和节思明[7]染色法分别观察细菌的运动性、鞭毛和荚膜。

1.2.2 培养性状与生化特性测定 取上述细菌分离菌分别接种10 g/L葡萄糖改良麦康凯琼脂平板、鲜血琼脂平板、胰蛋白胨大豆琼脂平板及普通营养琼脂平板等,同时接种各种生化反应管,置37 ℃温箱培养24 h48 h,观察结果。

1.2.3 PCR鉴定

1.2.3.1 引物设计 参照Hozbor D[8]报道,针对Bb FlaA基因上游序列选择合成1对引物,即Fla15′-TGGCGCCTGCCCTAT-3′Fla25′-AGGCTCCCAAGAGAGAAAGGCTT-3′其理论扩增幅度为237 bp,由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2.3.2 PCR扩增 将分离菌分别接种到胰蛋白胨大豆琼脂平板上,37 ℃培养24 h,挑取单个菌落,放入2 mL离心管,以每50 μL双蒸水一个菌落计,混匀后100 ℃煮沸10 min,冰块中冷却10 min,4 ℃10 000 r/min离心10 min,取上清液作为模板。PCR反应体系为30 μL:双蒸水21.5 μL10×buffer缓冲液(15 mmol/L MgCl2) 3 μLTaqDNA聚合酶1 μLdNTP0.5 μL、引物Fla1Fla2(10 μmo/L) 1.5 μL、模板1 μLPCR反应条件为:95 ℃5 min94 ℃ 30 s,56 ℃30 s,72 ℃40 s,35个循环;最后72 ℃10 min。取PCR产物5 μL,于20 g/L琼脂糖凝胶电泳,EB染色,凝胶成像系统观察。

1.2.3.3 PCR特异性与敏感性试验 按上述方法分别提取多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌和枯草芽孢杆菌的DNA模板进行PCR反应,检测PCR特异性;Bb菌株菌液DNA为模板经10倍连续稀释后,取各浓度进行PCR扩增,检测PCR的敏感度,同时按照常规方法进行细菌计数。

1.2.4 药物敏感性试验 按常规纸片法测定Bb分离菌对12种抗生素的敏感性。

2 结果

2.1 形态结构与染色特性

经抺片、染色镜检,34株细菌分离物均为G的短小杆菌,多呈单或成双排列,少数成短链状,不形成芽胞;压滴法可观察到细菌具有运动性,经硝酸银染色后,可见细菌有周鞭毛;节思明染色后发现细菌分离物有荚膜。

2.2 培养性状和生化鉴定

10 g/L葡萄糖改良麦康凯琼脂平板,34株细菌分离物均能耐受5 g/L胆盐抑制剂,发育为无色或茶黄色菌落;在鲜血琼脂平板上,所有菌均呈β溶血;在胰蛋白胨大豆琼脂平板上,所有菌呈无色、大小不等的菌落;在普通营养琼脂平板上,所有菌于24 h后可见针尖样小菌落,48 h即获得茂盛生长。所有分离物不能分解碳水化合物,即葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、木糖、果糖试验均为阴性,而过氧化氢,尿素酶、硫化氢,石蕊牛乳等试验均为阳性,能利用柠檬酸盐,还原硝酸盐,吲哚及MR反应阴性。

根据细菌分离菌的形态结构、染色特性、培养性状和生化鉴定等结果,34株分离菌均符合Bb的生物学特征。

2.3 PCR鉴定

Fla1/Fla2引物进行PCR反应,34株分离菌均扩增出一条约为240 bp的特异DNA条带(1和图2),与引物设计的预期片段大小一致。

117.B1B17M.200 bp标准;N.空白对照

1-17.B1-B17M.200 bp MarkerN.Blank control 

1 分离菌株B1B17PCR检测结果

Fig.1 The PCR results of B1-B17 isolates

1834.B18B34N.空白对照;M.200 bp标准

18-34.B18-B34N.Blank controlM.200 bp Marker

2 分离菌株B18B34PCR检测结果

Fig.2 The PCR results of B18-B34 isolates

2.4 PCR特异性与敏感性试验结果

分别提取Bb、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和大肠埃希菌等猪鼻腔和肺组织中常见细菌的DNA样本进行PCR,结果只有Bb扩增出一条大小约为240 bp的特异DNA条带,其他菌均未扩增出任何DNA条带(3)

M.200 bp标准;N.空白对照;1.多杀性巴氏杆菌;2.金黄色葡萄球菌;3.枯草芽孢杆菌;4.铜绿假单胞菌;

5.大肠埃希菌;6.Bb菌株;7.变形杆菌 

M.200 bp标准;N.空白对照;1.1022.1033.1044.1055.1066.B.bronchiseptica7.P.mirabillis

3 PCR特异性检测结果

Fig.3 Specificity of PCR results

Bb分离株不同稀释度即102103104105106菌液进行PCR扩增,结果稀释度为104的菌液在PCR扩增后可出现明显的DNA条带(4)。根据含菌量测定结果和文献资料[9]推算,104菌液的DNA含量为0.64 pg,即该PCR的最小检出量为0.64 pg

M.200 bp MarherN.Blank control1.1022.1033.1044.1055.106

M.200 bp MarherN.Blank control1.P.multocida2.S.aureus3.B.subtilis4.P.aeruginosa5.E.coli

4 PCR敏感性检测结果

Fig.4 Sensitivity of PCR results

2.3 药敏试验

34Bb分离物对12种抗菌素的敏感性见表1

1 34株细菌分离物的药敏试验结果

Table 1 The drug sensitivity test results of 34bacterial isolates

抗菌药物

Antimicrobial drugs

纸片药物含量

/(μg·1)

Drug concentration

判定标准

Criteria

耐药

Drug resistance

中敏

Middle sensitive

高敏

High sensitive

先锋霉素

VPioneer adriamycin V

30

14

15-17

18

多黏菌素

BPolymyxin B

300u

7

8-10

11

丙氟哌酸

C Norfloxacin

5

15

16-20

21

氟哌酸

Norfloxacin

10

12

13-16

17

利福平

Rifanpicin

5

16

17-19

20

青霉素

Penicillin

10u

28

29

卡那霉素

Kanamycin

30

13

14-17

18

庆大霉素

Gentamicin

10

12

13-14

15

四环素

Tetracycline

30

14

15-18

19

红霉素

Erythromycin

10

13

14-22

23

氯洁霉素

Chlorine lincomycin

2

14

15-20

21

链霉素

Streptomycin

10

11

12-14

15

从表1可见,34Bb分离株对多黏素B、丙氟哌酸、氟哌酸、卡那霉素和庆大霉素表现高度敏感,而对先锋霉素、利福平、青霉素、四环素、红霉素、氯洁霉素和链霉素表现不同程度耐药性。

3 讨论

从表现AR临床症状猪群中采取156份鼻腔棉拭子进行细菌学的分离鉴定,结果分离出34Bb,分离率为21.8%

根据Bb FlaA基因上游序列选择合成一对特异性引物(Fla1/Fla2),对34株分离株进行PCR鉴定,结果34株均扩增出一条大小约为240 bp的特异DNA条带,与传统的生理生化鉴定结果完全一致。且最小检出量为0.64 pg;对猪鼻腔和肺组织中常见的多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和枯草芽胞杆菌均呈阴性反应;说明该PCR方法具有较高的特异性和敏感性,与传统的细菌学鉴定方法比较,具有特异、敏感、简便、快速等特点,可用于AR病原(Bb)的临床鉴定。

临床上根据药物敏感性试验,可以给生产实践提供用药依据。本试验中34Bb分离株对多黏霉素B、丙氟哌酸、氟哌酸、卡那霉素和庆大霉素表现高度敏感,对链霉素等表现耐药;而边传周等[10]报道对庆大霉素表现耐药;韩洪伟等[11]报道对链霉素表现高度敏感。其差异性表现在细菌对抗生素很容易产生不同程度的耐药性,尤其是长时间应用抗生素的猪,因此建议临床上交叉使用药物。为了更好地控制本病,应采用综合防控措施,即疫苗接种为主,再辅以药物防治,同时加强饲养管理。

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