摘　要：观察钒对小鼠肌肉中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH­PX)活性的影响。用健康小鼠32只，随机分为4组。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别混饮10、5、2.5 mg/kg的偏钒酸铵，Ⅳ组为对照组，饮用蒸馏水，持续饮用20 d，利用谷胱甘肽过氧化物酶测试盒测定肌肉中的GSH­PX活性。结果表明，Ⅰ组肌肉中GSH­PX活性降低极显著(P<0.01)，Ⅱ组显著降低(P<0.05)，Ⅲ组肌肉中GSH­PX活性升高，但差异不显著(P>0.05)。说明偏钒酸铵在5 mg/kg～10 mg/kg剂量范围内可使肌肉中谷胱甘肽过氧化物酶活性降低。

    关键词：钒；小鼠；谷胱甘肽过氧化物酶

    随着人们对钒在动物和人体生物学作用和毒性作用的认识，钒的健康效应以及毒理学研究引起了人们广泛关注。钒有多种生物学功能，参与体内蛋白质、核酸、糖及脂类代谢，对维持机体生长发育，促进造血功能，增加机体免疫力等功能具有重要的调节作用[1]；适量的钒还能降低肝脏内磷脂和胆固醇的含量，降低血糖，增强心肌收缩力等。所以，近年来人们进行了用钒防治糖尿病和心血管疾病的研究[2­3]。服用低剂量的硫酸氧钒可能更有利于胰岛细胞的作用机能，通过提高胰岛素的作用，可用于治疗糖尿病[4]。但钒过量又可引起动物和人中毒。天然岩石的风化，煤、石油等燃料的燃烧、钛磁铁矿等含钒矿物的开采、冶金和工业用钒等又造成钒对环境的污染[5]。进入环境中的钒，可通过降雨作用、土壤吸附作用、植物根系作用经食物链进入动物体和人体而引起动物和人中毒。有关钒作用研究的报道多为机体中毒的症状和病理变化方面，关于钒对机体酶活性影响的研究报道较少。林杰等[6]研究了钒对实验动物的影响，结果发现钒对单胺氧化酶有双重作用。在浓度为0.01 mmol/L时，可增强单胺氧化酶的活力，使色氨酸氧化速度加快，高浓度(2.5 mg/kg～5.0 mg/kg)时，则抑制单胺氧化酶的活性。鸡饲料中添加量以雏鸡小于5 mg/kg， 蛋鸡小于10 mg/kg为宜，30 mg/kg的钒就能导致小鸡生长速度明显减慢[7]。但季辉等[8]研究结果却表明， 饲料中添加30 mg/kg 的钒，促进了肉鸡消化管的早期发育， 增强了机体消化吸收功能。然而，尚未见小鼠混饮钒酸盐对肌肉GSH­PX活性影响研究的报道。本研究观察钒对小鼠肌肉中GSH­PX活性的影响，为钒的生物学作用和毒理学方面的研究提供参考。

    1　材料与方法

    1.1　材料

    1.1.1　实验动物　成年健康的小鼠32只，雌雄各半，体重22 g～25 g，安徽科技学院实验动物中心提供。观察饲养2周。

    1.1.2　仪器　FA1004N型电子天平和YP600型电子天平为上海精密科学仪器有限公司产品，TDL80­2B型低速台式离心机和TGL­16C型高速台式离心机为上海安亭科学仪器厂生产，DY89­I型电动玻璃匀浆机为宁波新芝科器研究所生产，HH­S恒温水浴锅为江苏国胜试验仪器厂生产，BCD­520F型冰箱为青岛海尔冰箱股份有限公司生产，722型可见光分光光度计为上海精密科技分析仪器总公司制造，微量移液器为苏兰可调移液器X68382上海生产，TH2­C恒温震动器为太仓市光明实验分析仪器厂生产。

1.1.3　主要试剂　偏钒酸铵为上海试剂三厂生产，批号为049624；谷胱甘肽过氧化物酶(GSH­PX)测试盒，购于南京建成生物工程研究所，批号20050513；标准酪蛋白溶液(10 mg/mL)为10 g酪蛋白加0.05 mol/L氢氧化钠溶液至1 000 mL；双缩脲试剂：溶解1.5 g硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0 g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6·4H2O)于500 mL蒸馏水中，边搅拌边加入300 mL浓度为100 g/L的氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至1 L。

    1.2　方法

    1.2.1　动物的分组和混饮剂量　32只小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组8只。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组为试验组，每组按体重分别混饮剂量为10、5、2.5 mg/kg的偏钒酸铵；Ⅳ组为对照组，混饮同剂量的双重蒸馏水。每天早上饮用，每次混饮前禁水6 h，混饮2 h后给水，持续混饮20 d。各组雌、雄分笼饲养，饲养管理条件相同，试验期间细心观察各组小鼠的生长情况。

    1.2.2　肌肉组织匀浆的制备　宰杀前24 h停喂饲料，但不停水。颈椎脱臼处死，用手术剪剪去腿部皮肤，取后腿部肌肉一块，称重。用预冷的生理盐水漂洗去血液，用滤纸吸去表面水分，称重后置于5 mL的小烧杯内。用吸管吸取预冷总量2/3的生理盐水于烧杯中(生理盐水的用量为肌肉重量的9倍)，用眼科剪剪碎组织块。用玻璃匀浆机制备匀浆，转速600 r/min，研杵上下移动8次，将匀浆倒入量筒中，用剩余的(总量1/3)生理盐水冲洗玻璃匀浆管，将组织匀浆转移到离心管中，3 000 r/min离心15 min，将离心好的匀浆留上清液，弃去下面沉淀。用双缩脲法测定组织匀浆中蛋白含量。

    1.2.3　肌肉组织匀浆中蛋白质含量测定　用双缩脲法[10]测定组织匀浆中蛋白含量。取6支试管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的标准酪蛋白溶液，再分别加入1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0 mL蒸馏水，然后各加4.0 mL双缩脲试剂，室温放置30 min，于540 nm波长比色。最后以酪蛋白含量为Y，光密度为X，计算出直线的回归方程。

    吸取1 mL组织匀浆，加入1.0 mL蒸馏水和4.0 mL双缩脲试剂，与前同样比色，根据吸光度和回归方程求出待测浓度样本蛋白含量。

    1.2.4　肌肉中GSH­PX活性的测定　按GSH­PX的活性测定试剂盒说明书操作。按下列公式计算GSH­PX活力：组织GSH­PX酶活力(nmol·min－1·mg－1)＝(非酶管OD值－酶管OD值)/(标准管OD值－空白管OD值)×标准管浓度(20 μmol/L)×稀释倍数(5)/反应时间/待测浓度样本蛋白含量。

    1.2.5　试验数据处理　用SPSS 11.0 for windows软件对试验数据的进行统计分析，试验数据以 ±SD表示，进行t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

    2　结果

    2.1　标准蛋白吸光度的测定

    按双缩脲法测定标准酪蛋白的吸光度(表1)。根据表1中酪蛋白含量和测得的吸光度计算出回归方程[10]：Y＝0.065＋1.76X(r2＝0.982 3)

    2.2　组织蛋白吸光度和蛋白含量的测定

    按试验操作方法用分光光度计测出肌肉匀浆上清液的吸光度，根据方程：Y＝0.065＋1.76X计算出肌肉中的蛋白含量。

    2.3　GSH­PX活性

    按GSH­PX测定试剂盒说明书操作，根据每个肌肉样本的吸光度和计算GSH­PX活性公式计算出的GSH­PX活性(表1)。由表1可见，与对照组相比，2.5 mg/kg偏钒酸铵剂量组肌肉中GSH­PX活性略有升高，但差异不显著(P>0.05)，Ⅱ组肌肉中GSH­PX活性显著降低(P <0.05)，Ⅰ组肌肉中GSH­PX活性极显著降低(P<0.01)。

    表1　钒对肌肉中GSH­PX活性的影响

Table 1　Effect of vanadium on GSH­PX activity in muscle

组别 Groups	剂量/(mg·kg－1) Dose	GSH­PX活性/(nmol·min－1·mg－1) GSH­PX activity
Ⅰ	10	2.64±0.12**
Ⅱ	5	2.88±0.12*
Ⅲ	2.5	3.67±0.24
Ⅳ	蒸馏水 Distilled water	3.36±0.15

    注：与对照组(Ⅳ)比较，“*”P<0.05，“**”P<0.01。

    Note：Compared with control group， “*”P＜0.05，“**”P＜0.01.

    3　讨论

    GSH­PX能特异催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，使还原型谷胱甘肽(GSH)变成氧化型的谷胱甘肽，把有毒的过氧化物还原成无害的羟基化合物，使过氧化物分解和清除[11]。本试验结果表明偏钒酸铵在2.5 mg/kg剂量时肌肉中GSH­PX活性略有升高，但差异不显著(P>0.05)，说明偏钒酸铵在2.5 mg/kg剂量时对小鼠肌肉的GSH­PX活性无显著影响。偏钒酸铵在5 mg/kg～10 mg/kg剂量范围内降低小鼠肌肉GSH­PX活性，GSH­PX活性降低说明机体分解和清除过氧化物的能力减弱，使得过氧化物在体内积聚[12]，破坏了机体内自由基产生与清除之间的动态平衡，使氧自由基代谢紊乱，加剧了自由基对机体的氧化损伤。

    关于钒中毒机理的研究表明，钒在细胞内以氧化剂(VO2＋)形式发挥其生理功效，氧钒离子在中性溶液中可自动氧化产生钒酸盐和氧自由基，但VO2＋会干扰体内氧自由基的代谢而对组织细胞产生氧化损伤[13]。当机体中钒过量时，机体清除自由基的能力降低，体内自由基增加，破坏了机体内自由基产生与清除之间的动态平衡，使自由基在体内大量积累，从而破坏生物膜脂质双层结构，使膜流动性下降，刚性增加，同时攻击膜内巯基，使膜脆性增加，转运受到影响，最终导致机体细胞(或细胞器)损伤及其功能降低[14]。

    本试验结果与崔胜先等[15]在日粮中添加4.02 mg/kg钒于试验期45 d和添加大剂量(16 mg/kg和64 mg/kg)的钒对肉用鸡血液抗氧化功能的影响结果一致，但所用动物不同，给钒的途径不同，试验时间长短不同。李才等[3]研究了钒酸盐对糖尿病大鼠组织自由基防御机制的影响，在水中加入100 mg/L和200 mg/L的钒酸钠后，大鼠肝中还原型GSH含量和肾超氧化物歧化酶(SOD)活性无明显影响；但肾谷胱甘肽过氧化物(GSH­PX)活性降低，肾脂质过氧化物(LPO)含量上升，GSH­PX/LPO降低，证明了钒酸盐具有过氧化性。李才等的研究结论与本试验结论一致。

    由于本试验受到各种条件限制，所用动物相对较少，也未对其组织损伤变化进行研究，关于偏钒酸铵使谷胱甘肽过氧化物酶活性的降低的机理还有待于进一步研究。