口蹄疫疫苗研究进展--打印文章

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物的烈性传染病之一。由于FMD暴发引起幼小动物死亡、成年动物生产能力降低，并由此而导致疫区畜产品禁运，造成重大经济损失。目前，FMD呈全世界范围流行趋势。疫苗接种作为特异性预防的可靠工具和有效手段，在FMD的防控中已被广泛使用，并取得了显着成效，目前仍在许多国家和地区应用。有FMD流行的国家每年进行有计划的免疫接种，无FMD或已消灭FMD的国家和地区仍在国际疫苗库中储备了一定数量的疫苗。因此，高质量安全有效的FMD疫苗的研制和不断改进，不但是决定疫苗效果的关键，亦是成功地预防和控制以至最终消灭FMD的先决条件。

1灭活疫苗的研究

1931年4月27柏林微生物学会首次召开了FMD学术会议，奠定了FMD疫苗研究基础。Frenkel H S等[1]成功地实现了FMDV体外培养，不但满足了FMDV疫苗的规模化生产要求，而且实现了对病毒的定量研究。目前用于FMD疫苗生产的细胞主要是BHK-21细胞。疫苗生产过程主要包括FMDV的细胞培养，FMDV细胞培养物的浓缩、灭活，佐剂的加入，安全性检验和效力检验等程序。进行FMD疫苗生产时首先要考虑FMDV血清型，其次要了解当地FMD的流行情况，最终确定用于FMD疫苗生产的毒株。如果对当地FMD流行情况不了解，或本地区进出口贸易把关不严，周边国家或其他距离较远的国家FMD有可能传入本国或地区时，FMD疫苗生产就要选择所有可能对本地区构成威胁的FMDV毒株。比如一些阿拉伯半岛国家，就选择了8株FMDV用于疫苗的生产，以期生产出能够预防本国或地区所有潜在FMD疫苗。尽管FMD灭活疫苗在FMD预防和控制上，发挥了重要作用，但是灭活疫苗本身也存在许多安全隐患，国外学者先后用分子生物学方法证明欧洲暴发的FMD是因使用了灭活不全的FDM疫苗引起的。具有讽刺意义的是在欧洲国家尽管通过免疫成功实现对FMD暴发流行控制，但在1992年欧洲经济委员会还是放弃了疫苗的使用，该决策是否正确，还有待观察，因为在西欧的一些周边国家仍然存在FMD的流行。

2新型疫苗研究

2 .1病毒载体疫苗

在漫长的自然进化过程中，病毒是以寄生形式存活下来的最小、最简单的生命体，随着病毒分子生物学的深入发展，为生物工程研究领域拓展了思路，提供了有效的方法和工具。以病毒为载体的新型疫苗成为了基因工程的研究热点之一，病毒重组活载体疫苗可被视为减毒活疫苗和亚单位蛋白质疫苗的结合，它既可以避免亚单位疫苗需要佐剂和多次接种注射的缺点，又可以诱导全面而持久的免疫反应。可作为减毒活疫苗的病毒载体有痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒、脊髓灰质炎病毒和单纯疱疹病毒等，目前已用于FMD疫苗研究的载体主要有痘病毒、腺病毒和杆状病毒载体等。

2.1.1FMDV腺病毒重组活载体疫苗人腺病毒弱毒疫苗的安全有效使用，奠定了腺病毒作为载体研制的基础。第1代腺病毒载体起于20世纪80年代初，至今腺病毒载体已经经历了4代发展[2-3]。在腺病毒载体快速发展的同时，Sanz Parra A等[4]用人的可复制的5型腺病毒疫苗株（Ad5 wt）载体，构建了表达FMDV结构蛋白P1基因的重组腺病毒活载体疫苗Ad5-P1。用Ad5 wt和重组的Ad5-P1经皮下或鼻内接种牛，在第2次免疫后鼻内滴注口蹄疫病毒进行攻毒。虽然未检测出抗口蹄疫病毒抗体，但经重组病毒皮下接种两次的所有动物均得到有效的保护。后来，Mayr G A等[5]构建了可以表达FMDV衣壳蛋白P1-2A和3C蛋白酶基因的非复制型人5型腺病毒载体，被挑选出来两个重组病毒：含有3C蛋白酶的Ad5-P1和在蛋白酶编码区进行点突变的抑制多聚蛋白加工的Ad5-P12X3CMUT。在293个病毒感染细胞中，FMDV的衣壳蛋白均能合成，但能够将其加工成结构蛋白VP0、VP3和VP1的仅仅是Ad5-P12X3CWT病毒感染的细胞。通过用型特异性的单克隆抗体进行的免疫沉淀试验，结果表明，在Ad5-P12X3CWT病毒感染的细胞中可能形成较为高级的结构形式。口蹄疫病毒常经肌肉接种小鼠产生相应的免疫反应，但仅仅含有3CWT的病毒才能表达中和抗体反应。在增加基础免疫以后，中和抗体反应的程度增加了。猪肌肉接种AD5-P12X3CWT重组病毒后能够产生中和抗体，并可完全或部分保护与人工接种强毒的动物相接触的猪免受病毒的感染。因此，腺病毒可以作为一种有效的表达FMDV的主要决定簇的抗原的载体，诱导高水平的中和抗体的产生，并保护动物免受FMDV的攻击。

Du Y等[6]腺病毒载体构建了VP1基因和VP1主要抗原表位分别与巨噬细胞集落刺激因子共表达的重组活载体疫苗rAd-GMCSF-VPe 和rAd-GMCSF-VP1，研究结果表明两种疫苗均能诱导机体产生较高水平的FMDV特异性T淋巴细胞增殖反应、IFN-gamma和IL-4，而且rAd-GMCSF-VPe 和rAd-GMCSF-VP1均能对猪和豚鼠产生攻毒保护。

2.1.2FMDV痘病毒重组活载体疫苗痘苗病毒载体是研究最早和最成功的病毒载体之一。痘苗病毒具有宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区等优点，有利于进行基因工程操作和适于插入多个外源基因且抗原性稳定、免疫原性持久，能够同时诱发体液和细胞免疫，相对安全。

Berinstein以痘苗病毒为载体构建了表达FMDV C3Arg85株衣壳蛋白前体P1基因的重组FMDV疫苗，免疫后可检测到高水平的FMDV和痘苗病毒的中和抗体，类似于灭活疫苗免疫所产生的抗体水平。经小鼠免疫试验表明，重组痘苗病毒抗FMDV的有效免疫原可以作为活载体疫苗。但痘苗病毒本身存在一些难以克服的缺点，如感染谱广，容易引发痘病等。有人采用金丝雀痘病毒为载体表达FMDV的VP1，其表达效率要比以痘苗病毒为载体高出100倍，具有良好的应用前景[7]。

此外，鸡痘病毒表达载体具有安全、高效、外源基因容量大，宿主范围较小等优点，为疫苗的研究提供了可能，具有很好的发展前景。作者所在课题组郑敏等用鸡痘病毒作载体构建了共表达FMDV P1-2A和3C基因的重组疫苗，在小鼠和豚鼠免疫试验均表现出较好的免疫效果，并且在豚鼠攻毒试验中，可抵抗250 MID50同源病毒攻毒[8]。在此基础上Ma Mingxiao等[9]构建用鸡痘病毒作载体构建了共表达FMDV P1-2A,3C和猪IL18基因的重组疫苗，进一步提供了该重组疫苗的免疫效果，在猪的攻毒试验中，保护率可达到4/5。

2.1.3FMDV伪狂犬病毒载体重组活载体疫苗伪狂犬病毒载体就是通过基因工程技术使伪狂犬病毒载体中的毒力基因失活，使病毒的毒力减弱，但病毒粒子仍然保持良好的抗原性，能够有效地刺激机体产生免疫应答。重组病毒粒子同插入的外源基因一起在动物体内表达不仅十分安全，还可以做到一针多防，提高生产效率。伪狂犬病毒载体在基因表达、疫苗研制、基因投递和基因治疗等方面都显示了很好的优越性。Yao Q等[10]用伪狂犬病毒载体构建了共表达O型FMDV的P12A3C基因的重组活载体疫苗，并与用P12A3C构建的DNA疫苗免疫效果进行了比较，结果表明，FMDV伪狂犬病毒重组活载体疫苗能诱导较高的抗体水平，对豚鼠的攻毒可完全保护，而DNA疫苗抗体水平较低，对豚鼠的攻毒只能部分保护。

2.2核酸疫苗

DNA疫苗是指那些注入动物体内后能够诱导机体产生免疫反应的病毒保护性抗原基因表达质粒。早在20世纪70年代末，人们就证实了动物体内具有摄取裸露DNA分子的能力。20世纪80年代中期，利用克隆的目的基因，通过体内直接转染的方法大量用于基因治疗途径的研究。近几年，基因免疫在FMDV免疫研究中得到广泛的应用。

Beard C等[11]构建了两个不同的质粒，一个质粒pP12X3C携带有FMDV衣壳蛋白前体基因P1和蛋白酶3C基因，用基因枪将该质粒接种动物可检测到特异性的体液反应。第2个DNA质粒pWRMHX，携带有编码完整病毒的基因组（但删除了其细胞结合位点），用该质粒接种猪后可以产生病毒样粒子并诱导产生中和抗体。比较两种质粒pP12X3C和pWRMHX接种猪后的效果结果显示，携带有复制病毒基因组的质粒DNA可以产生较强的免疫力，应用pWRMHX经肌肉注射、鼻内接种和基因枪途径接种的猪均对强毒攻击产生部分保护力。

Chan E W等[12]构建pCEIM和pCEIS两个质粒，它们分别含有FMDV的VP1基因的主要抗原位点（氨基酸残基的第141位～160位和200位～213位氨基酸）和鼠及猪的免疫球蛋白基因。用它们分别接种小鼠（腹部皮下）和猪（耳背部皮下），前者可刺激小鼠产生特异性的T淋巴细胞增生和中和抗体。后者两次免疫的猪也出现T淋巴细胞增生（SI可达8.1），并产生高效价的中和抗体。在攻毒实验中，应用pCEIS 进行免疫的猪可百分之百的保护。

Ma Mingxiao等[13]在总结国内外学者研究的基础上，利用FMDV 2A蛋白自身裂解性和双启动真核表达载体，构建了FMDV P1-2A、猪IL-18和FMDV 3C共表达的核酸疫苗pVIR-P12AIL18-3C和不携带猪IL-18的核酸疫苗pVIR-P12A-3C，研究结果表明，两个核酸苗均对同源FMDV对猪的攻毒具有很好的保护性，且携带有猪IL-18基因的核酸苗免疫效果优于不携带猪IL-18的核酸疫苗。

2.3亚单位疫苗与合成肽疫苗

FMDV的结构蛋白主要由VP1、VP2、VP3和VP4组成，其中VP1是诱导机体产生免疫反应的主要结构蛋白。20世纪80年代以来，人们以FMDV的结构蛋白VP1,146 S和12 S蛋白亚单位等作为抗原免疫牛和豚鼠均可产生沉淀抗体、补体结合抗体及中和抗体。Vasantha等用脂质体包裹O型和Asia 1型FMDV的VP1制备亚单位疫苗，免疫豚鼠产生了高水平的中和抗体，小规模的田间试验也取得了比较好的效果。Kield等应用重组DNA技术首次在大肠埃希菌中表达了口蹄疫病毒主要保护性抗原VP1。以这种融合蛋白制备的实验疫苗，在牛和猪中均可诱导中和抗体产生。使用152 μg的融合蛋白重复接种，牛可抵抗A型口蹄疫病毒的攻击。Huang等则用含有半乳糖苷酶和一个完整的FMDV VP1蛋白主要抗原决定簇的重组融合蛋白接种豚鼠和猪，可以产生特异性的中和抗体，起到有效的保护作用。Bitlle 根据口蹄疫病毒O1型VP1氨基酸序列分析资料，化学合成了140-160段氨基酸与载体蛋白偶联，能诱导保护豚鼠的中和抗体。Dimarch用合成的O1K病毒VP1的141段～158段和200段～213段氨基酸组成40个氨基酸短肽，在其中间加上两个脯氨酸和一个丝氨酸使多肽拆成立体构型，大大提高了单段肽在豚鼠的应答水平，并提出了VP1羧基端氨基酸在提高保护应答中的重要性。

这些亚单位疫苗与合成肽疫苗的免疫原性均基于它们能递呈VP1蛋白G-H环上的关键的抗原表位。然而，这些抗原位点不仅不是病毒粒子上惟一的中和性位点，也不一定能被所有的宿主动物识别，这导致这些疫苗在大规模使用时候，效果并不理想。如Taboga等应用138头牛进行4种合成肽疫苗的效果检测。结果表明各免疫组虽可产生相应的的免疫反应，甚至高水平的中和抗体，但它们对免疫动物的攻毒保护率没有一个在40%以上。此外，由于FMDV的高变异性和准种特性，使用有些的抗原表位，不仅不能有效地诱导保护性免疫，还会加速病毒的变异速度。如Taboga等就在未保护牛中分离到突变逃逸株。

2.4表位疫苗

研究表明，O型FMDV衣壳表面至少有5个抗原位点，其中位于VP1 140位～160位氨基酸处的A位点和位于VP1 C端200位～213位氨基酸C位点是两个B细胞表位能够诱导机体产生特异的FMDV中和抗体；AsiaI型FMDV抗原位点与O型FMDV相似；C型FMDV有4个抗原位点，A型FMDV抗原位点的命名和定位比较混乱，利用A10的单克隆抗体反应把A型FMDV的抗原位点分为4组。近年来为研制广谱的FMDV疫苗，FMDV非结构蛋白的抗原位点也引起了学者的关注，并且已经取得了较好的研究成果。基于对FMDV抗原位点的研究，国内外学者相继进行了FMDV多表位疫苗的研究。Zhang Hong-ying等[14]对FMDV 5个主要抗原表位和VP1上的T细胞表位，通过不同组合构建5种DNA疫苗，通过对免疫原性研究表明，含有T细胞表位和抗原位点1,5的DNA疫苗免疫效果好于其他组合的DNA疫苗。另外，为了增强FMDV B细胞表位的免疫原性，Winther和Yahong Huang等先后将B细胞表位与乙型肝炎病毒（HBV）核蛋白融合表达，形成病毒样粒子，构建DNA疫苗或转染烟草构建了转基因植物多表位疫苗。Marchi等以钥孔虫戚血兰素作为骨架与B细胞表位融合表达，构建FMDV表位疫苗，通过对豚鼠、牛和猪的动物攻毒实验均表现出了良好的保护性。

李光金等[15]人工合成O 型FMDV 结构蛋白VP1 之上的141位～160位及21位～40位氨基酸残基2 个表位基因，并采用猪免疫球蛋白G（ IgG）重链恒定区作为载体蛋白，将合成的抗原表位基因连接在载体蛋白基因的3′端，再克隆进真核表达载体pCDM8 中，构建成重组表达质粒pCDM8FZ3，检测了其诱发豚鼠产生免疫应答的情况。结果表明，构建的DNA 疫苗对豚鼠的保护率达66%，效果远远强于以整个IgG重链作为载体的DNA疫苗。马鸣潇等人利用计算机软件模拟分析，对O型、A型和Asia1型FMDV优势抗原表位进行了分子设计，先后构建了O型、A型和Asia1型FMDV复合多表位DNA疫苗和鸡痘病毒重组活载体疫苗[16-17]。

2.5可饲（食）疫苗

可饲（食）疫苗即利用农杆菌或基因枪等技术，将免疫原性基因导入植株中，获得能表达免疫原基因的植株。FMD 转基因植物可饲疫苗是研究较早，并且效果较好的例子之一。早在1998 年，Carrillo 等用FMDV 的主要保护性抗原基因VP1 获得了转基因拟南芥，用叶浸提物免疫小鼠，可诱导产生特异性抗体，所有免疫的小鼠都能抵抗FMDV 强毒半数致死量的攻击，这是有关转基因植物表达的病毒抗原使免疫动物全部获得保护的首篇报道，而且一个免疫剂量仅为25 mg～50 mg 叶片。2001年Carrillo 等以马铃薯作为受体材料，成功获得了表达FMDV VP1 的转基因马铃薯，动物试验证实免疫鼠也能抵抗强毒的攻击[18]。

最近Santos M D等[19]又利用苜蓿作为受体材料，成功获得了共表达FMDV P1基因和3C基因的转基因苜蓿，进行鼠免疫能100 %抵抗致死剂量强毒的攻击。FMDV 转基因植物可饲疫苗的研究成功，将为牛、羊等草食动物FMD 的防治带来光明的前景。

2003年Wu Ligang等[20]用烟草作为受体，分别表达FMDV VP1蛋白上的11个氨基酸和14个氨基酸短肽的转基因植物疫苗TMVF11和TMVF14。小鼠、豚鼠和猪的免疫试验研究结果表明，两种TMVF11和TMVF14的混合物免疫小鼠可以保护乳鼠抵抗10个乳鼠的半数致死量（SMLD50）的攻击，免疫豚鼠，可抵抗150个豚鼠半数感染量（GPID50）的攻击，而猪可抵抗20个最小感染量（MID）FMDV 的攻击。

2008年Pan L等[21]在西红柿中实现了FMDV P1-2A基因和3C基因，其提取物可对豚鼠的攻毒产生完全保护，表明该转基因的西红柿有望成为预防FMDV的新型疫苗。

倪志华等[22]在粳稻品种日本晴中成功表达了口蹄疫O 型抗原决定簇和A 型抗原决定簇构成的融合基因O21-O14-A 21。

李文建等[23]在胡萝卜中也成功地表达该融合基因。这些研究成果为我国FMDV转基因疫苗的研究奠定了基础。

总之，尽管新型基因工程疫苗的快速发展给FMDV疫苗研究带来了新的变革，然而，新型基因工程疫苗也普遍存在着明显的不足，即新型基因工程疫苗刺激机体产生免疫应答的能力往往比常规疫苗接种引起的免疫反应弱，这就给新型基因工程疫苗的研究提出了新的挑战。因此，新型疫苗佐剂已成为当今倍受关注的研究热点。目前，作为新型基因工程疫苗的佐剂主要有细胞因子、CpG岛、超抗原SEA（staphylococcus enterotoxin A， SEA）、脂质体、中药佐剂及某些化学合成试剂等，这些新型基因工程疫苗的佐剂在FMDV新型疫苗研究中已被广泛应用。